Escherichia coli produtora da toxina Shiga (STEC) é um microrganismo agente de infecções de amplo espectro clínico. A expressão de intimina e a produção de enterohemolisina são atributos de virulência também descritos no grupo patogênico. Ruminantes, especialmente bovinos, são reconhecidos como o principal reservatório das STEC. O estudo incluiu 301 isolados de E. coli obtidos de amostras fecais de bovinos de regiões do Rio de Janeiro e Rondônia. Ensaios moleculares revelaram que 55,5% (167/301) das amostras de E. coli foram carreadoras do gene stx, 36,2% (109/301) e 21,3% (64/301) dos genes eae+ e ehxA+, respectivamente. Dentre as STEC, 24 foram isoladas do Rio de Janeiro (14,4%, 24/167) e 143 de Rondônia (85,6%, 143/167). 13 genótipos de virulência foram observados: stx1/stx2/eae/ehxA, stx1/stx2/eae, stx1/stx2/ehxA, stx1/stx2, stx1/eae/ehxA, stx1/ehxA, stx1, stx2/eae/ehxA, stx2/eae, stx2/ehxA, stx2, eae/ehxA e ehxA). 3,6% (6/167) e 93,4% (156/167) das STEC foram carreadoras dos genes rfbO113 e rfbO157+, respectivamente, sendo 64,1% desses rfbO157+h7+ (100/156). A tipagem da região LEE revelou os subtipos eaeα (3/109), eaeβ (6/109), eaeγ (4/109), tirα (2/109), tirβ (3/109), tirγ (3/109), espAα (3/109), espAβ (0/109), espAγ (0/109), espBα (1/109), espBβ (9/109) e espBγ (0/109). A filogrupagem classificou as STEC nos grupos A (44,9%), B1 (47,3%), D (6,6%) e B2 (1,2%). A tipagem pelo RAPD- revelou uma ampla diversidade genética entre as STEC indicando constituir uma população bacteriana de origem não clonal. A elevada prevalência desses patógenos em animais de propriedades rurais representa um sério risco ambiental, propiciando a exposição e a ocorrência de doenças.