Os receptores P2Y2 e P2Y4 são receptores purinérgicos ativados fisiologicamente pelo UTP e pelo ATP. Eles são expressos em diferentes tecidos em humanos, onde promovem uma série de efeitos fisiológicos, incluindo a mobilização de cálcio intracelular. Além disso, a inibição desses receptores pode gerar efeitos antiinflamatórios, analgésicos, antimetastáticos e laxativos, que demonstram o seu potencial terapêutico. Todavia, a escassez de moléculas antagonistas dificulta a implementação de fármacos com ação sobre esses receptores na terapia, o que estimula a busca por novas moléculas que apresentem essa atividade. Em vista disso, o objetivo desse trabalho foi padronizar uma metodologia de triagem de alto desempenho capaz de identificar novos antagonistas dos receptores P2Y2 e P2Y4. Essa metodologia é baseada na mensuração dos níveis de cálcio intracelular, cujo protocolo foi testado e otimizado a fim de fornecer as condições adequadas para a realização dos ensaios. Além disso, foram testadas concentrações crescentes de ionomicina, ATP e UTP no intuito de avaliarmos a sensibilidade do equipamento. Com isso, obtivemos os valores de EC50 de 103 nM, 10 μM e 1,021 μM, respectivamente. Por fim, foi conduzida uma mini-campanha de triagem de alto desempenho utilizando amostras de extratos vegetais. Esses experimentos revelaram que o extrato de galhos de Joannesia princeps Vell. foi capaz de inibir a mobilização de cálcio intracelular de forma concentração-dependente, apresentando um IC50 de 32,32 μg/mL. Portanto, a metodologia padronizada foi capaz de identificar novos antagonistas para os receptores P2Y2 e P2Y4 de origem natural.